Aké testy na koronu vlastne existujú?

V posledných týždňoch sme sa všetci dozvedeli viac ako sme kedy chceli vedieť o vírusoch, antimikrobiálnych prostriedkoch a procedúrach, ktoré sa skôr používajú vo vedeckých laboratóriach pri práci s bunkovými kultúrami a mikroorganizmami. Sledujeme, koľko diagnostických testov a aké k nám prichádzajú, diskutujeme, či je počet testov dostatočný a polemizujeme o tom, koľko stáli a koľko mohli stáť. Poďme sa teraz pozrieť na to, aké druhy testov sa na SARS-CoV-2 používajú. Úplne na začiatok si musíme povedať 4 dôležité veci:

Každý diagnostický test, ktorý sa má použiť v Európskej únii, musí mať známku CE, ktorá (momentálne do určitej miery) zaručuje, že zloženie testu, jeho technické prevedenie a hlavne klinické použitie zabezpečí, že test „funguje“. Test musí mať klinicky stanovené, aká je jeho špecificita a senzitivita, čiže koľko určí falošne pozitívnych a koľko prípadov nezachytí vôbec, dôležitý pri pandémii je hlavne ten druhý prípad. Okrem toho, musí mať test stanovenú aj technickú citlivosť a špecificitu, t.j aké sú krajné hodnoty, ktoré je možné technicky s testom zachytiť. Okrajovo poznamenávam, že pravdepodobne nijaký test na 100% nezaručí, že zachytí všetky prípady alebo že všetky pozitívne prípady sú naozaj pozitívne. Nové EU pravidlá na diagnostické testy, ktoré vstúpia do platnosti v máji 2022, budú oveľa prísnejšie ako tie dnešné a bude náročnejšie ich splniť.
Nemocnice, respektíve zdravotnícke zariadenia si môžu diagnostický test pripraviť aj sami, a to hlavne vtedy, ak komerčný CE test nie je k dispozícii. Môžu ním testovať len pacientov vo vlastnom zariadení. Tieto testy však tiež musia spĺňať určité nevyhnutné podmienky a musia sa porovnávať s pozitívnymi či negatívnymi kontrolami.
Ak má krajina na to vedecký a klinický potenciál, mala by zapracovať na tom, aby testovanie vlastného obyvateľstva robila vo vlastnej réžii, s použitím bežne dostupných chemikálií a prostriedkov a s testom/testami, ktoré majú šancu získať CE značku. Dôležité je, aby testy boli prispôsobené realite krajiny, dostupnému prístrojovému vybaveniu a ľudským zdrojom pre odber vzoriek a testovanie. Vo svetle informácií o budúcich vlnách a nových vírusových infekciach by bolo asi najvhodnejšie mať vyvinutú platformu, v ktorej by sa špecifické súčasti dali jednoducho vymeniť, validovať a použiť na nové testovanie nového vírusu či mutantu „starého“ vírusu.
Všetky uvedené druhy testov majú svoju hodnotu, len je ich treba použiť v správnom čase, zo správnych dôvodov a v správnej kombinácii.

V zásade máme tieto druhy diagnostických testov:

Testy založené na kultivácii intaktných vírusov zo vzoriek z respiračného traktu, zo stolice a zriedkavo z moču či tkaniva sa pri bežnej diagnostike takmer vôbec nepoužívajú kvôli nebezpečnosti a zdĺhavosti. Tieto metódy sú však dôležité pri detekcii kmeňa vírusu, ktorý koluje v populácii a pri zisťovaní celkovej sekvencie vírusu a stanovení rýchlosti či rozsahu mutácií pôvodného kmeňa. Tieto informácie sú dôležité pre poznanie „nepriateľa“.
Testy založené na detekcii nukleovej kyseliny SARS-CoV-2, v prípade tohto konkrétneho vírusu sa jedná o RNA vírus. To znamená, že obsahuje RNA molekuly a popri tom aj proteíny a sacharidy, ktoré sa nazývajú glykány.

Tieto testy, ak sú nastavené správne, detekujú prítomnosť vírusu na určitom mieste v organizme v určitom čase- v prípade SARS-CoV-2 sa najčastejšie robia výtery z hrdla a nosa a zisťuje sa prítomnosť v týchto vzorkách. Podľa informácií z Číny, prítomnosť nukleových kyselín (v tomto prípade RNA) SARS-CoV-2 bola potvrdená v krvi u asi 40% pacientov a v stolici asi u 60% pacientov, ktorí mali vírus vo výteroch z hrdla a nosa.

Testy na stanovenie RNA vírusu sa najčastejšie robia pomocou metódy RT-PCR, kde sa z vyizolovanej RNA syntetizuje DNA a pomocou špecifických primerov sa stanoví, či sa vo vzorke nachádza daný vírus. Tieto testy sa považujú za najcitlivejšie a najhodnovernejšie, bežne však trvá dlhšie sa dopracovať k výsledku.

Pred pár dňami však bol napríklad v USA schválený test firmy Abott, ktorý využíva ich platformu ID NOW™ a stanoví SARS-CoV-2 vo vzorkách pomocou „namnoženia“ (amplifikácie) nukleových kyselín do 30 minút. Takýto test sa dá použiť priamo v ambulancii, prípadne v nemocnici na rýchle stanovenie SARS-CoV-2. Vyžaduje však špecifické malé prenosné zariadenie a špecifické chemikálie. Test v jednom momente môže však analyzovať len jednu vzorku, čo nie je veľmi použiteľné na skríning pacientov.

Silnou stránkou testov založených na RNA/DNA je vysoká citlivosť (aj keď je potrebné klinickú a technickú citlivosť stanoviť pri každom takomto teste) a možnosť automatizácie. Slabou stránkou testov môže byť napríklad sústredenie sa na nevhodné/nešpecifické častí vírusu, čím sa neodlíšia podobné vírusy. Správnym nastavením testu sa tieto nedostatky dajú odstrániť.

Testy založené na stanovení vírusových antigénov, čo znamená priamu detekciu proteínových častí prítomného vírusu. Vírusové antigény sú vlastne tie molekuly, proti ktorým vie telo zamerať špecifickú imunologickú obranu a neskôr aj vytvoriť protilátky, keď sa vírus dostane do organizmu. Výhodou týchto testov je ich rýchlosť, môžu byť vyhodnotené okamžite (z vhodnej vzorky, najčastejšie z hrdla a nosa, prípadne zo stolice a dokonca aj z krvi) a môžu byť dostupné aj ako domáce testy. Nevýhodou je, že pri tejto metóde sa testovaná látka „nenamnoží“ tak ako pri teste RT-PCR a preto má test obyčajne nižšiu citlivosť. Nižšia citlivosť znamená, že test na SARS-CoV-2 bude pozitívny až pri určitom počte vírusových častíc prítomných vo vzorke. Ďaľšou nevýhodou je, že je potrebné v laboratóriu vytvoriť špecifické činidlá (protilátky), pomocou ktorých sa vírusové proteíny budú stanovovať.
Testy založené na imunitnej odpovedi organizmu na prebiehajúcu infekciu, ide o stanovenie protilátok v krvi pacientov. Každá infekcia vyvoláva imunitnú reakciu organizmu, v prípade nového mikroorganizmu telo musí nanovo vytvoriť na daný patogén odpoveď. V rámci imunitnej odpovede telo aktivuje špecifické nástroje a to hlavne bunkovú imunitnú odpoveď, T-lymfocyty a protilátkovú imunitnú odpoveď, tvorbu špecifických protilátok. Okrem toho je aktivovaná aj vrodená imunita a množstvo nešpecifických molekúl je uvoľnených do krvi v snahe zvládnuť boj proti patogénu.

Na tvorbe protilátok je založená aj aktívna imunizácia alebo očkovanie, kde sa vytvárajú podmienky na tvorbu protilátok, schopných zasiahnúť proti mikroorganizmu. Tvorba protilátok je v neskoršej fáze nahradená prítomnosťou buniek, ktoré sú schopné protilátky okamžite produkovať, keď sa telo opäť stretne s tým istým patogénom.

Stanovenie protilátok v krvi má nesmierny význam a to hlavne z 3 hlavných dôvodov:

Prítomnosť špecifických protilátok je dôkazom toho, že telo sa s infekciou nedávno stretlo a daný pacient je do určitej miery a do určitého času (v prípade SARS-CoV-2 zatiaľ nevieme túto mieru a čas) odolný voči ďalšej infekcii tým istým mikroorganizmom a mohol by sa zapojiť do bežného života, napríklad do zdravotnej starostlivosti bez nebezpečenstva ďalšej nákazy.
Jedinci s vysokou koncentráciou neutralizačných alebo celkových protilátok môžu byť zdrojom lieku pre najťažšie prípady. Neutralizačné protilátky sú napríklad také, ktoré zabraňujú vírusu preniknúť do bunky a atakovať orgány, napr. pľúca.
Celoplošné testovanie populácie na prítomnosť protilátok môže spätne pomôcť zistiť, aký bol rozsah epidémie na danom území, čo môže byť dôležité pre stanovenie úmrtnosti a pre sledovanie účinnosti opatrení, pre zistenie správania sa vírusu a pre budúce modelovanie.

Okrem stanovenia neutralizačných protilátok v teste priamo s vírusom sa môžu použiť aj kvantitatívne metódy, ktoré pri správnom dizajne a nastavení nepotrebujú pracovať priamo s vírusmi. Stanovenie protilátok z krvi sa robí pomocou testov EIA, respektíve ELISA. V zásade musíme mať pre test v skúmavke k dispozícii antigén, t.j. proteínovú časť vírusu, ktorá je schopná vyvolať v ľudskom tele tvorbu protilátok. Tento antigén sa môže vyrobiť aj synteticky alebo biotechnologicky a je to úplne neinfekčný materiál.

Ak by sme vzali do úvahy predchádzajúcu epidémiu SARS-CoV v roku 2003, tak protilátky IgM aj IgG sa v krvi detekovali už 7.deň po infekcii vírusom. Protilátky IgM sa z krvi vytrácali po približne 2-3 mesiacoch, čiže predstavovali viac akútnu časť infekcie, respektíve skorú post-akútnu fázu. IgG pretrvali v krvi približne 12 mesiacov. Podobné poznatky zatiaľ nie sú veľmi dostupné pre SARS-CoV-2, aj z toho dôvodu, že sa všetci sústreďujú logicky na skoré a spoľahlivé zistenie prítomnosti vírusu viac ako na stanovenie protilátok.

Pre zaujímavosť prikladám článok, ktorý síce ešte nebol recenzovaný, ale ponúka pohľad a návod na zostavenie protilátkového testu.

Iná diagnostika– napríklad digitálna diagnostika. Už dnes sú validované a vo vývoji metódy, ktoré diagnostikujú COVID19 ako ochorenie spôsobené vírusom SARS-CoV-2 pomocou charakteristického obrazu CT pľúc. Pre účely Slovenska nie je táto diagnostika relevantná, lebo CT sa nepoužíva v takej miere. Môže sa však aplikovať na iné, bežnejšie zobrazovanie a to RTG. Iné experimentálne metódy sa zameriavajú na stanovenie tzv. prchavých organických látok v dychu pacienta. Výskumníci tiež testujú elektrické stanovenie nukleoproteínu vírusu SARS-CoV-2 pomocou nanosenzorov a aptamérov.

Z existencie veľkého množstva už certifikovaných testov či testov vo vývoji je zrejmé, že záujem firiem či inštitúcií je veľký. Najväčší počet testov má z pochopiteľných dôvodov Čína. Pekný prehľad je možné nájsť napríklad na tejto stránke.

Krajina by si mala sama určiť, ako bude postupovať pri získavaní a zavádzaní relevantných testov. Do úvahy je treba brať aj nasledovné faktory:

Dostupnosť odborných pracovníkov na analýzy
Dostupnosť odberových tímov a mobilných jednotiek
Dostupnosť zariadení na testovanie
Dostupnosť základných chemikálií
Informácie o kmeni /kmeňoch vírusu na svojom území
Dostupnosť relevantného know-how v tej-ktorej krajine a možnosť vytvorenia vlastného CE testu

V každom prípade by však mala byť zabezpečená jednotná platforma, kde by sa zhromažďovali relevantné informácie a ukladali dáta. Krajina by si mala zabezpečiť zhromažďovanie vzoriek od svojej populácie, aby mohla získať dôležité vedecké poznatky pre zvládnutie ďalších vĺn epidémie na svojom území ako aj v európskom či svetovom priestore. Mala by sa vytvoriť biobanka obyvateľstva, v ktorej by sa zhromaždili údaje o chorých, ich testoch a ďalších parametroch a ich biologické vzorky. Vytvorenie takejto databanky by malo začať u potvrdených chorých a malo by pokračovať naprieč obyvateľstvom.

Pre vytvorenie a fungovanie biobanky je potrebná podpora štátu a súčinnosť relevantných stakeholderov. Biobanka by samozrejme mohla a mala byť využívaná aj na iné ochorenia ako koronavírus. V biomedicínskom svete tvorí národná biobanka a jej prepojenie na iné národné biobanky nevyhnutnú súčasť výskumu a vývoja- či už nových liekov, diagnostiky, zdravotníckych pomôcok či postupov a prevencie.