Aké testy na koronu vlastne existujú?
V posledných týždňoch sme sa všetci dozvedeli viac ako sme kedy chceli vedieť o vírusoch, antimikrobiálnych prostriedkoch a procedúrach, ktoré sa skôr používajú vo vedeckých laboratóriach pri práci s bunkovými kultúrami a mikroorganizmami. Sledujeme, koľko diagnostických testov a aké k nám prichádzajú, diskutujeme, či je počet testov dostatočný a polemizujeme o tom, koľko stáli a koľko mohli stáť. Poďme sa teraz pozrieť na to, aké druhy testov sa na SARS-CoV-2 používajú. Úplne na začiatok si musíme povedať 4 dôležité veci:
- Každý diagnostický test, ktorý sa má použiť v Európskej únii, musí mať známku CE, ktorá (momentálne do určitej miery) zaručuje, že zloženie testu, jeho technické prevedenie a hlavne klinické použitie zabezpečí, že test „funguje“. Test musí mať klinicky stanovené, aká je jeho špecificita a senzitivita, čiže koľko určí falošne pozitívnych a koľko prípadov nezachytí vôbec, dôležitý pri pandémii je hlavne ten druhý prípad. Okrem toho, musí mať test stanovenú aj technickú citlivosť a špecificitu, t.j aké sú krajné hodnoty, ktoré je možné technicky s testom zachytiť. Okrajovo poznamenávam, že pravdepodobne nijaký test na 100% nezaručí, že zachytí všetky prípady alebo že všetky pozitívne prípady sú naozaj pozitívne. Nové EU pravidlá na diagnostické testy, ktoré vstúpia do platnosti v máji 2022, budú oveľa prísnejšie ako tie dnešné a bude náročnejšie ich splniť.
- Nemocnice, respektíve zdravotnícke zariadenia si môžu diagnostický test pripraviť aj sami, a to hlavne vtedy, ak komerčný CE test nie je k dispozícii. Môžu ním testovať len pacientov vo vlastnom zariadení. Tieto testy však tiež musia spĺňať určité nevyhnutné podmienky a musia sa porovnávať s pozitívnymi či negatívnymi kontrolami.
- Ak má krajina na to vedecký a klinický potenciál, mala by zapracovať na tom, aby testovanie vlastného obyvateľstva robila vo vlastnej réžii, s použitím bežne dostupných chemikálií a prostriedkov a s testom/testami, ktoré majú šancu získať CE značku. Dôležité je, aby testy boli prispôsobené realite krajiny, dostupnému prístrojovému vybaveniu a ľudským zdrojom pre odber vzoriek a testovanie. Vo svetle informácií o budúcich vlnách a nových vírusových infekciach by bolo asi najvhodnejšie mať vyvinutú platformu, v ktorej by sa špecifické súčasti dali jednoducho vymeniť, validovať a použiť na nové testovanie nového vírusu či mutantu „starého“ vírusu.
- Všetky uvedené druhy testov majú svoju hodnotu, len je ich treba použiť v správnom čase, zo správnych dôvodov a v správnej kombinácii.
V zásade máme tieto druhy diagnostických testov:
- Testy založené na kultivácii intaktných vírusov zo vzoriek z respiračného traktu, zo stolice a zriedkavo z moču či tkaniva sa pri bežnej diagnostike takmer vôbec nepoužívajú kvôli nebezpečnosti a zdĺhavosti. Tieto metódy sú však dôležité pri detekcii kmeňa vírusu, ktorý koluje v populácii a pri zisťovaní celkovej sekvencie vírusu a stanovení rýchlosti či rozsahu mutácií pôvodného kmeňa. Tieto informácie sú dôležité pre poznanie „nepriateľa“.
- Testy založené na detekcii nukleovej kyseliny SARS-CoV-2, v prípade tohto konkrétneho vírusu sa jedná o RNA vírus. To znamená, že obsahuje RNA molekuly a popri tom aj proteíny a sacharidy, ktoré sa nazývajú glykány.
Tieto testy, ak sú nastavené správne, detekujú prítomnosť vírusu na určitom mieste v organizme v určitom čase- v prípade SARS-CoV-2 sa najčastejšie robia výtery z hrdla a nosa a zisťuje sa prítomnosť v týchto vzorkách. Podľa informácií z Číny, prítomnosť nukleových kyselín (v tomto prípade RNA) SARS-CoV-2 bola potvrdená v krvi u asi 40% pacientov a v stolici asi u 60% pacientov, ktorí mali vírus vo výteroch z hrdla a nosa.
Testy na stanovenie RNA vírusu sa najčastejšie robia pomocou metódy RT-PCR, kde sa z vyizolovanej RNA syntetizuje DNA a pomocou špecifických primerov sa stanoví, či sa vo vzorke nachádza daný vírus. Tieto testy sa považujú za najcitlivejšie a najhodnovernejšie, bežne však trvá dlhšie sa dopracovať k výsledku.
Pred pár dňami však bol napríklad v USA schválený test firmy Abott, ktorý využíva ich platformu ID NOW™ a stanoví SARS-CoV-2 vo vzorkách pomocou „namnoženia“ (amplifikácie) nukleových kyselín do 30 minút. Takýto test sa dá použiť priamo v ambulancii, prípadne v nemocnici na rýchle stanovenie SARS-CoV-2. Vyžaduje však špecifické malé prenosné zariadenie a špecifické chemikálie. Test v jednom momente môže však analyzovať len jednu vzorku, čo nie je veľmi použiteľné na skríning pacientov.
Silnou stránkou testov založených na RNA/DNA je vysoká citlivosť (aj keď je potrebné klinickú a technickú citlivosť stanoviť pri každom takomto teste) a možnosť automatizácie. Slabou stránkou testov môže byť napríklad sústredenie sa na nevhodné/nešpecifické častí vírusu, čím sa neodlíšia podobné vírusy. Správnym nastavením testu sa tieto nedostatky dajú odstrániť.
- Testy založené na stanovení vírusových antigénov, čo znamená priamu detekciu proteínových častí prítomného vírusu. Vírusové antigény sú vlastne tie molekuly, proti ktorým vie telo zamerať špecifickú imunologickú obranu a neskôr aj vytvoriť protilátky, keď sa vírus dostane do organizmu. Výhodou týchto testov je ich rýchlosť, môžu byť vyhodnotené okamžite (z vhodnej vzorky, najčastejšie z hrdla a nosa, prípadne zo stolice a dokonca aj z krvi) a môžu byť dostupné aj ako domáce testy. Nevýhodou je, že pri tejto metóde sa testovaná látka „nenamnoží“ tak ako pri teste RT-PCR a preto má test obyčajne nižšiu citlivosť. Nižšia citlivosť znamená, že test na SARS-CoV-2 bude pozitívny až pri určitom počte vírusových častíc prítomných vo vzorke. Ďaľšou nevýhodou je, že je potrebné v laboratóriu vytvoriť špecifické činidlá (protilátky), pomocou ktorých sa vírusové proteíny budú stanovovať.
- Testy založené na imunitnej odpovedi organizmu na prebiehajúcu infekciu, ide o stanovenie protilátok v krvi pacientov. Každá infekcia vyvoláva imunitnú reakciu organizmu, v prípade nového mikroorganizmu telo musí nanovo vytvoriť na daný patogén odpoveď. V rámci imunitnej odpovede telo aktivuje špecifické nástroje a to hlavne bunkovú imunitnú odpoveď, T-lymfocyty a protilátkovú imunitnú odpoveď, tvorbu špecifických protilátok. Okrem toho je aktivovaná aj vrodená imunita a množstvo nešpecifických molekúl je uvoľnených do krvi v snahe zvládnuť boj proti patogénu.
Na tvorbe protilátok je založená aj aktívna imunizácia alebo očkovanie, kde sa vytvárajú podmienky na tvorbu protilátok, schopných zasiahnúť proti mikroorganizmu. Tvorba protilátok je v neskoršej fáze nahradená prítomnosťou buniek, ktoré sú schopné protilátky okamžite produkovať, keď sa telo opäť stretne s tým istým patogénom.
Stanovenie protilátok v krvi má nesmierny význam a to hlavne z 3 hlavných dôvodov:
- Prítomnosť špecifických protilátok je dôkazom toho, že telo sa s infekciou nedávno stretlo a daný pacient je do určitej miery a do určitého času (v prípade SARS-CoV-2 zatiaľ nevieme túto mieru a čas) odolný voči ďalšej infekcii tým istým mikroorganizmom a mohol by sa zapojiť do bežného života, napríklad do zdravotnej starostlivosti bez nebezpečenstva ďalšej nákazy.
- Jedinci s vysokou koncentráciou neutralizačných alebo celkových protilátok môžu byť zdrojom lieku pre najťažšie prípady. Neutralizačné protilátky sú napríklad také, ktoré zabraňujú vírusu preniknúť do bunky a atakovať orgány, napr. pľúca.
- Celoplošné testovanie populácie na prítomnosť protilátok môže spätne pomôcť zistiť, aký bol rozsah epidémie na danom území, čo môže byť dôležité pre stanovenie úmrtnosti a pre sledovanie účinnosti opatrení, pre zistenie správania sa vírusu a pre budúce modelovanie.
Okrem stanovenia neutralizačných protilátok v teste priamo s vírusom sa môžu použiť aj kvantitatívne metódy, ktoré pri správnom dizajne a nastavení nepotrebujú pracovať priamo s vírusmi. Stanovenie protilátok z krvi sa robí pomocou testov EIA, respektíve ELISA. V zásade musíme mať pre test v skúmavke k dispozícii antigén, t.j. proteínovú časť vírusu, ktorá je schopná vyvolať v ľudskom tele tvorbu protilátok. Tento antigén sa môže vyrobiť aj synteticky alebo biotechnologicky a je to úplne neinfekčný materiál.
Ak by sme vzali do úvahy predchádzajúcu epidémiu SARS-CoV v roku 2003, tak protilátky IgM aj IgG sa v krvi detekovali už 7.deň po infekcii vírusom. Protilátky IgM sa z krvi vytrácali po približne 2-3 mesiacoch, čiže predstavovali viac akútnu časť infekcie, respektíve skorú post-akútnu fázu. IgG pretrvali v krvi približne 12 mesiacov. Podobné poznatky zatiaľ nie sú veľmi dostupné pre SARS-CoV-2, aj z toho dôvodu, že sa všetci sústreďujú logicky na skoré a spoľahlivé zistenie prítomnosti vírusu viac ako na stanovenie protilátok.
Pre zaujímavosť prikladám článok, ktorý síce ešte nebol recenzovaný, ale ponúka pohľad a návod na zostavenie protilátkového testu.
- Iná diagnostika– napríklad digitálna diagnostika. Už dnes sú validované a vo vývoji metódy, ktoré diagnostikujú COVID19 ako ochorenie spôsobené vírusom SARS-CoV-2 pomocou charakteristického obrazu CT pľúc. Pre účely Slovenska nie je táto diagnostika relevantná, lebo CT sa nepoužíva v takej miere. Môže sa však aplikovať na iné, bežnejšie zobrazovanie a to RTG. Iné experimentálne metódy sa zameriavajú na stanovenie tzv. prchavých organických látok v dychu pacienta. Výskumníci tiež testujú elektrické stanovenie nukleoproteínu vírusu SARS-CoV-2 pomocou nanosenzorov a aptamérov.
Z existencie veľkého množstva už certifikovaných testov či testov vo vývoji je zrejmé, že záujem firiem či inštitúcií je veľký. Najväčší počet testov má z pochopiteľných dôvodov Čína. Pekný prehľad je možné nájsť napríklad na tejto stránke.
Krajina by si mala sama určiť, ako bude postupovať pri získavaní a zavádzaní relevantných testov. Do úvahy je treba brať aj nasledovné faktory:
- Dostupnosť odborných pracovníkov na analýzy
- Dostupnosť odberových tímov a mobilných jednotiek
- Dostupnosť zariadení na testovanie
- Dostupnosť základných chemikálií
- Informácie o kmeni /kmeňoch vírusu na svojom území
- Dostupnosť relevantného know-how v tej-ktorej krajine a možnosť vytvorenia vlastného CE testu
V každom prípade by však mala byť zabezpečená jednotná platforma, kde by sa zhromažďovali relevantné informácie a ukladali dáta. Krajina by si mala zabezpečiť zhromažďovanie vzoriek od svojej populácie, aby mohla získať dôležité vedecké poznatky pre zvládnutie ďalších vĺn epidémie na svojom území ako aj v európskom či svetovom priestore. Mala by sa vytvoriť biobanka obyvateľstva, v ktorej by sa zhromaždili údaje o chorých, ich testoch a ďalších parametroch a ich biologické vzorky. Vytvorenie takejto databanky by malo začať u potvrdených chorých a malo by pokračovať naprieč obyvateľstvom.
Pre vytvorenie a fungovanie biobanky je potrebná podpora štátu a súčinnosť relevantných stakeholderov. Biobanka by samozrejme mohla a mala byť využívaná aj na iné ochorenia ako koronavírus. V biomedicínskom svete tvorí národná biobanka a jej prepojenie na iné národné biobanky nevyhnutnú súčasť výskumu a vývoja- či už nových liekov, diagnostiky, zdravotníckych pomôcok či postupov a prevencie.